茶葉中真菌毒素的污染及快速定量檢測方案--8min準(zhǔn)確定量

閱讀次數(shù)：次 2018.11.27

　　一、真菌毒素概述

　　真菌毒素是某些真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的，危害人和動物的次級毒性代謝產(chǎn)物。迄今發(fā)現(xiàn)超過400種真菌毒素，主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、單端孢霉烯族毒素中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2 玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、雜色曲霉素、桔青霉素等。真菌毒素主要由曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬中產(chǎn)生。這些微生物廣泛分布在植物、土壤和空氣當(dāng)中，可能污染谷物、大豆、堅果、水果、調(diào)味料、可可、咖啡、中草藥等植物性食物及其制品(如葡萄、啤酒)、飼料等。并可能在原料、加工、儲藏等環(huán)節(jié)污染食物或飼料，從而進(jìn)入食物鏈。世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計顯示，每年全世界有25%的谷物受到真菌毒素污染，由此，美國年均損失約93.2億美元。另外谷類和堅果中的真菌毒素可能是非洲、亞洲和南美洲消費(fèi)者面臨的食品中最主要的不安全因素。

　　二、茶葉中存在哪些真菌毒素

　　近年來關(guān)于茶葉尤其普洱茶等經(jīng)過微生物發(fā)酵茶葉的真菌毒素污染已引起消費(fèi)者的關(guān)注。茶葉是指茶樹的干燥嫩葉與嫩莖，已成為世界上除了水之外消費(fèi)最多的飲料，其安全性對消費(fèi)者的健康以及茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤其重要。產(chǎn)毒真菌分布廣泛，茶園土壤和加工車間等都有可能存在，茶葉加工可能受到產(chǎn)毒真菌污染。雖然干燥環(huán)節(jié)可能殺滅紅茶、綠茶中的大多數(shù)微生物，但干燥之后如果包裝、貯藏不當(dāng)，尤其茶葉吸濕受潮之后，可能受到真菌和真菌毒素污染。而普洱茶、茯磚茶等黑茶后發(fā)酵過程及產(chǎn)品中本身存在曲霉屬、青霉屬等多種真菌菌種，也可能受真菌毒素污染。但目前僅見印度對紅茶的黃曲霉素做了限量規(guī)定(30ug/kg)。GB2761—2017未規(guī)定茶葉制品真菌毒素限量。

　　2.1. 紅茶真菌毒素相關(guān)研究

　　紅茶是指茶樹鮮葉經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等步驟生產(chǎn)出來的茶葉產(chǎn)品，是世界上產(chǎn)量最大的茶葉類別，也是除中國、日本外其他國家的主要消費(fèi)品種，因此目前關(guān)于紅茶污染真菌毒素的研究報道相對較多。

　　早在1974年，日本學(xué)者Hitokoto等就開展了東京市售茶葉毒素產(chǎn)生菌污染的研究，從東京市售的19份紅茶樣品中，分離得到259 株泡盛曲霉，檢測發(fā)現(xiàn)這些真菌可在酵母蔗糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生雜色曲霉素，表明紅茶受到了毒素產(chǎn)生菌的污染。Abdel-Hafez等應(yīng)用薄層層析測定發(fā)現(xiàn)，4份紅茶粉樣品受到黃曲霉毒素B1和B2污染，含量為2.8~2.17 mg/kg。Hasan 等從埃及市售的20個品牌紅茶粉中分離得到多株黃曲霉，檢測發(fā)現(xiàn)其中15 株可產(chǎn)黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2，5株可產(chǎn)生黃曲霉毒素B1和B2;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，茶葉接種產(chǎn)毒菌株后，可產(chǎn)生黃曲霉素，且毒素含量隨含水量增大而增加;茶葉含水量45%，28℃，培養(yǎng)20d的條件下毒素含量最大，可達(dá)26～ 81ug/kg。Elshafie 等從購于馬斯喀特的4 個品牌48份紅茶樣品中，分離鑒定出5種真菌，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)分離的25株黃曲霉均不產(chǎn)生黃曲霉毒素。Ostry等在紅茶中檢測到了可能產(chǎn)生黃曲霉素的黃曲霉菌株。Martins等測定發(fā)現(xiàn)，購于里斯本的18份紅茶樣品中，有16份樣品污染了伏馬菌素B1，含量為80~280mg/kg，未檢測到伏馬菌素B2。Miraglia報道，1995-1998年歐盟國家檢測了139份紅茶樣品，其中8份樣品中赭曲霉毒素A陽性，含量為0.03~10.3 μg/kg。Hasan發(fā)現(xiàn)接種黃曲霉菌株之后，脫咖啡因紅茶中的黃曲霉毒素是普通茶葉的5倍。R?ezác等分析發(fā)現(xiàn)，布拉格市售的10個紅茶樣品受到真菌污染，但符合捷克的標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)毒試驗表明分離的真菌不產(chǎn)黃曲霉毒素。Santos 等應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測了西班牙市售的包括紅茶在內(nèi)的84個藥用或芳香植物中的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、桔青霉素和伏馬菌素，發(fā)現(xiàn)樣品普遍受到毒素污染。Mogensen 等發(fā)現(xiàn)從紅茶中分離到的Aspergillusacidus不產(chǎn)生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素B2 和B4。Monbaliu等建立了一個可同時測定27 種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測了91份茶葉樣品，結(jié)果只有1 份樣品檢測到伏馬菌素B1(76ug/kg)。

　　研究發(fā)現(xiàn)紅茶中真菌數(shù)量及毒素含量與含水量有關(guān)，茶葉受潮后真菌會大量繁殖、產(chǎn)生毒素。真菌孢子在加工的很多環(huán)節(jié)都可能污染紅茶、綠茶等茶葉產(chǎn)品，但真菌生長及產(chǎn)生毒素需要一定的水分，如果茶葉干燥徹底、貯藏過程不受潮，即使茶葉含有真菌孢子，但不會繁殖，也不會產(chǎn)生真菌毒素。因此，對于紅茶、綠茶等茶葉加工企業(yè)來說，可以通過徹底干燥、及時包裝或真空包裝、儲存運(yùn)輸過程不受潮，來降低或杜絕真菌毒素污染的風(fēng)險。對于茶葉消費(fèi)者來說，打開包裝之后應(yīng)檢查茶葉是否霉變、開封后的茶葉必須干燥存放、勿飲用霉變茶葉，避免受到真菌毒素危害。

　　2.2. 黑茶真菌毒素研究

　　黑茶指制造工序為鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆(后發(fā)酵)、干燥，成品茶呈油黑或黑褐的茶種。主要有云南普洱茶、湖南茯磚茶、四川康磚茶、廣西六堡茶等。由于獨(dú)特品質(zhì)及良好的保健功效，近年來黑茶產(chǎn)量及消費(fèi)量都逐漸增大。但普洱茶等黑茶加工有一個多種微生物作用的后發(fā)酵過程，這些微生物可能產(chǎn)生毒素。如普遍認(rèn)為的普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢菌黑曲霉是一般公認(rèn)安全的微生物，但近年來發(fā)現(xiàn)黑曲霉的某些菌株可能產(chǎn)生赭曲霉毒素和伏馬毒素;茯磚茶的優(yōu)勢菌散囊菌屬的一些菌種也可產(chǎn)生赭曲霉毒素和伏馬毒素等真菌毒素。目前有關(guān)黑茶真菌毒素污染的風(fēng)險已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，部分學(xué)者開展了相關(guān)研究。

　　Hitokoto 等分析了共11 份茶葉樣品，其中2 份為普洱茶樣品，發(fā)現(xiàn)普洱茶真菌數(shù)量最多，優(yōu)勢菌是雜色曲霉和聚多曲霉;其中1 株雜色曲霉在小麥培養(yǎng)基上產(chǎn)生了雜色曲霉素，但在綠茶中未產(chǎn)生毒素;聚多曲霉在葡萄糖酵母和小麥培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生毒素。陳秋娥分析了44 件臺灣市售普洱茶樣品，未檢測到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、雜色曲霉素和桔青霉素;同時陳秋娥還研究了黃曲霉在普洱茶發(fā)酵中的產(chǎn)毒素情況，發(fā)現(xiàn)不接種黃曲霉菌株的普通發(fā)酵(對照組)和不滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的發(fā)酵樣品均未檢出黃曲霉毒素;滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的樣品檢出黃曲霉毒素(1.05 ug/kg)，該研究表明正常的普洱茶發(fā)酵過程不會產(chǎn)生黃曲霉毒素。Abe等應(yīng)用HPLC 檢測發(fā)現(xiàn)，從普洱茶中分離的黑曲霉不產(chǎn)生赭曲霉毒素A和伏馬菌素。Mogensen等檢測發(fā)現(xiàn)，從普洱茶樣品中分離的Aspergillusacidus不產(chǎn)生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素B2和B4。HOU 等檢測發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黑曲霉和炭黑曲霉(A.Carbonarius)發(fā)酵的茶葉樣品不含赭曲霉毒素A和伏馬菌素。陳建玲等隨機(jī)抽查廣州某茶葉市場濕倉儲存的普洱茶70 份樣品，發(fā)現(xiàn)其中8 份樣品(11.43%) 黃曲霉毒素B1>5μg/kg，63份樣品(90%)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染> 1 mg/kg，伏馬毒素(B1 和B1)和T-2 毒素毒素含量雖然都分別小于1mg/kg 和100μg/kg，但在樣品中均可檢出，應(yīng)引起廣泛重視。ZHANG等應(yīng)用免疫層析法檢測，并用高效液相色譜?質(zhì)譜法(HPLC-MS)驗證，發(fā)現(xiàn)5 份普洱茶樣品都含有黃曲霉毒素，含量為4.9 ～59.3 μg/kg。柳其芳應(yīng)用酶聯(lián)免疫測試盒測定，發(fā)現(xiàn)普洱茶黃曲霉毒素污染水平超過20 μg/kg 的有10 份(16.6%)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染水平超過1000μg/ kg 的有13份(23.0%);玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、赭曲霉毒素、T-2 毒素在樣品中均可檢出。Haas等檢測了36 份普洱茶樣品，未檢測到黃曲霉素(B1，B2，G1和G2)和伏馬菌素(B1，B2 和B3)，4 份樣品檢測到赭曲霉毒素A，含量為0.65 ～ 94.7 μg/kg。趙浩軍等應(yīng)用HPLC 方法檢測了市售普洱茶2 份樣品，均未檢出黃曲霉毒素B1。

　　陳秋娥接種黃曲霉菌株發(fā)酵普洱茶的研究表明，正常的普洱茶發(fā)酵過程不會產(chǎn)生黃曲霉素，Abe等、Mogensen 等和HOU等3 個獨(dú)立研究都表明，普洱茶發(fā)酵過程的曲霉菌種不產(chǎn)生赭曲霉毒素A 和伏馬菌素。以上研究均表明，正常的普洱茶發(fā)酵不會產(chǎn)生真菌毒素。由于樣品及測定方法不同，關(guān)于普洱茶產(chǎn)品中真菌毒素檢測的報道不一致。陳建玲等、ZHANG 等和柳其芳檢測的普洱茶樣品較大程度受到黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素和T-2 毒素污染;而陳秋娥和趙浩軍等分別檢測了44和2份市售普洱茶樣品，未檢出毒素。Haas 等分析了36 份樣品的8 種真菌毒素，僅4份樣品檢測到赭曲霉毒素A。

　　近年來有關(guān)黑茶的真菌毒素污染引起了廣泛關(guān)注，應(yīng)加強(qiáng)過程控制，檢測發(fā)酵過程真菌是否產(chǎn)生毒素;篩選、應(yīng)用不產(chǎn)毒素菌株發(fā)酵并監(jiān)測是否產(chǎn)毒，建立安全的黑茶發(fā)酵技術(shù)體系。

　　2.3. 其他茶葉真菌毒素研究

　　有關(guān)綠茶、白茶中真菌毒素的研究不多，僅Reezácˇová 等分離10 份捷克市售綠茶樣品中的真菌，發(fā)現(xiàn)均不產(chǎn)生黃曲霉毒素。Santos等檢測了西班牙市售的綠茶和白茶樣品，發(fā)現(xiàn)部分檢測樣品受到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2 毒素和桔青霉素污染。趙浩軍等檢測了2份綠茶樣品，未檢出黃曲霉毒素B1。

　　綜上，無論黑茶、紅茶、綠茶都可能受到真菌毒素的污染。飲用真菌毒素污染的茶葉對健康不利，但另一方面，也有大量文獻(xiàn)研究表明，綠茶、紅茶、普洱茶等都具有“解毒”作用，可以降低黃曲霉毒素等真菌毒素的毒性。因此今后應(yīng)開展茶葉真菌毒素的風(fēng)險評估研究，準(zhǔn)確評估茶葉中真菌毒素對人體健康的風(fēng)險。我國茶葉加工工藝與制品類別眾多，生產(chǎn)廠家也很多，且多數(shù)規(guī)模不大，因此更應(yīng)重視茶葉可能受到毒素污染的情況。建議開展不同品種茶葉制品真菌毒素檢測研究，普查各類茶葉制品受到真菌毒素污染情況，并根據(jù)真菌毒素污染情況，制定茶葉毒素的限量指標(biāo)。對于有微生物參與發(fā)酵的茶類(如黑茶)，通過應(yīng)用不產(chǎn)毒素菌株發(fā)酵、監(jiān)控發(fā)酵過程毒素等措施建立安全的發(fā)酵技術(shù)。我國茶葉企業(yè)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)茶葉毒素的過程控制及監(jiān)測，降低茶葉受到真菌毒素污染的風(fēng)險，以保障飲用安全。

　　三、南京微測生物茶葉中真菌毒素快速定量檢測方案--8min準(zhǔn)確定量

　　南京微測生物基于熒光定量FPOCT技術(shù)平臺，推出了常見的六種真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測系統(tǒng)，包含真菌毒素檢測儀和真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測試紙條，可在8min快速準(zhǔn)確定量的檢測出茶葉中真菌毒素的殘留含量，樣品前處理簡單，檢測操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠且可現(xiàn)場打印，準(zhǔn)確性符合HPLC法的檢測結(jié)果，適用于各類茶葉加工企業(yè)、第三方檢測機(jī)構(gòu)及政府監(jiān)管部門。